Saat ini teknik spektroskopi gaya sebuah molekul (single-molecule force spectroscopy) hampir selalu bergantung pada teknik atomic force microscopy (AFM) dan pinset magnetik dan optik(optical and magnetic tweezers). Metode-metode tersebut telah merevolusi bidang kimia dan biologi karena memungkinkan investigasi pembentukan dan penguraian struktur 3 dimensi protein (folding and unfolding proteins) dan elastisitas DNA. Namun ada beberapa masalah eIkan. Zebra merupakan hewan terbaik untuk menggambarkan epilepsi, pada manusia eksperimen yang dihasilkan begitu sedikit karena metode-metode tersebut tidak bisa bekerja secara paralel. Masalah lainnya adalah dengan kedua metode tersebut, dibutuhkan penghubung fisis antara dunia nanoskopis dan makroskopis. Penghubung ini mengakibatkan pengukuran yang dilakukan rentan terhadap gangguan luar yang mengakibatkan noise dan perpindahan yang tak diinginkan.

Sebuah cara baru dilakukan oleh tim peneliti yang dipimpin oleh Tim Liedl dengan menciptakan sebuah alat yang dapat bekerja secara mandiri dan dapat melakukan manipulasi secara nanoskopis. Mereka menggunakan DNA origami untuk mengkonstruksi alat berukuran nanoskopis yang dapat menyelesaikan permasalahan-permasalahan diatas. Single-stranded DNA digunakan untuk melakukan gaya yang dapat diubah-ubah yang bekerja dengan prinsip entropi (fluktuasi termal mengakibatkan tegangan pada single-stranded DNA sehingga ia mengerjakan gaya pada objek yang diinginkan). Gaya ini dikerjakan pada sebuah sistem molekular. Prinsip kerja dari alat nanoskopis ini dapat dilihat pada skematik yang ditampilkan pada Gambar 1. Single-stranded DNA dihubungkan dengan dua buah titik ujung yang berfungsi sebagai jangkar (titik yang diam). Dengan mengubah-ngubah jumlah dari basa nukleotida (nucleotides) dari single-stranded DNA maka gaya entropi yang bekerja pada sistem molekular (dilambangkan dengan kotak berwarna merah pada Gambar 1) juga akan berubah. Semakin panjang basa nukleotida yang digunakan, maka semakin kecil gaya yang bekerja.

Skematik dari Penjepit nanoskopis

Gambar 1. Skematik dari Penjepit nanoskopis

Dalam realisasi eksperimen yang mereka lakukan, single-stranded DNA terbentang diantara celah dari rangka DNA origami yang berbentuk penjepit dan sangat kokoh yang dibuat dengan menggunakan strand DNA dari M13mp18 yang sangat panjang. Mereka meletakkan beberapa titik untuk kloning (menumbuhkan sel, DNA dan lainnya) diantara pegas-pegas dari single-stranded DNA (ssDNA spring). Hal ini memungkinkan mereka untuk memasukkan dan menyelidiki sebuah sistem molekular yang dibuat dari susunan-susunan DNA. Sebuah single-stranded DNA yang melingkar juga diletakkan di ujung-ujung luar rangka penjepit DNA origami sehingga mereka dapat mengubah-ubah gaya yang bekerja pada objek yang ingin di investigasi, lihat Gambar 2.

Penjepit nanoskopis, single-stranded DNA, dan reservoir

Gambar 2. Kiri: Struktur dari penjepit nanoskopis dimana ditampilkan juga pegas-pegas single-stranded DNA (ssDNA spring) dan reservoir ssDNA. Diperlihatkan diagram dari gaya-gaya yang bekerja pada rangka dan juga sistem molekular yang ingin diinvestigasi. Kanan: beberapa skematik dari beberapa gaya yang memperlihatkan peran dari ssDNA spring dan ssDNA reservoir untuk menghasilkan besar gaya yang berbeda

Untuk membuat struktur ini, mereka melakukan proses pemanasan bertahap (thermal annealing) dari larutan campuran penyusun DNA origami (DNA M13mp18, staple DNA, dan larutan buffer) sehingga dihasilkan 1012 struktur penjepit dalam sebuah tabung reaksi. Mereka menggunakan suhu pemanasan dibawah 65 °C untuk menghindari degradasi termal dari rangka yang dihasilkan. Gambar 3 memperlihatkan struktur asli dari rangka penjepit DNA origami yang yang diambil dengan menggunakan transmission electron microscopy (TEM) dan dilengkapi dengan keterangan dari gaya-gaya yang dapat dikerjakannya.

Hasil TEM dari penjepit nanoskopis

Gambar 3. Hasil TEM dari penjepit nanoskopis

Untuk mendemonstrasikan fungsi dan sensitivitas dari penjepit nanoskopis ini, mereka melakukan kloning susunan DNA diantara celah rangka penjepit ini dengan membentuk sebuah struktur yang sangat popular dan telah banyak dilakukan studi terhadapnya. Struktur tersebut bernama Holliday junction (HJ). Sebelumnya, penjepit nanoskopis ini telah di immobilisasi di suatu permukaan dengan menggunakan suatu molekul yang dapat berikatan dengan rangka penjepit dan suatu permukaan, lihat Gambar 4B bagian atas. Ketika HJ berada dalam lingkungan yang mengandung ion magnesium maka ia akan membentuk struktur yang menyerupai huruf X akibat dari susunan bertumpuk dari lengan-lengan DNA, lihat Gambar 4B bagian bawah. Diketahui bahwa HJ secara konstan berubah-ubah dari konformasi ISO I dan ISO II. Proses perubahan dari ISO I ke ISO II dan sebaliknya dapat diamati dengan bantuan Foster Resonance Energy Transfer (FRET) yaitu metode pengamatan yang memanfaatkan transfer energi antara molekul donor dan akseptor (penerima). Ketika HJ membentuk ISO I maka molekul donor akan memancarkan cahaya dalam rentang panjang gelombang biru dan ketika HJ membentuk struktur ISO II maka ada perpindahan energi dari donor ke akseptor yang mengakibatkan molekul akseptor memancarkan cahaya dalam rentang panjang gelombang berwarna merah, lihat Gambar 4A untuk ilustrasi.

Skematik perpindahan ISO I ke ISO II

Gambar 4. (A) Skematik dari proses perpindahan dari ISO I ke ISO II dan sebaliknya dengan ilustrasi FRET yang terjadi. (B) Rangka penjepit nanoskopis yang telah diimobilisasi pada suatu permukaan yang memiliki Holliday junction (HJ) ditengah-tengah rangka penjepit.

Dibawah pengaruh beberapa  gaya yang besarnya berbeda-beda dari 0 pikonewton hingga 4 pikonewton yang dikerjakan oleh pegas single-stranded DNA, mereka mengukur laju perubahan dari konformasi ISO I ke ISO II dan sebaliknya dengan mengamati perubahan pancaran cahaya dari sistem-sistem nanoskopis ini dengan menggunakan mikroskop optik . Hasil yang mereka dapatkan sesuai dengan hasil-hasil yang telah dipublikasi sebelumnya yaitu laju dari ISO I ke ISO II didapat sebesar 4.7 per detik pada gaya 0 pikonewton bertambah menjadi 18.3 per detik saat gaya yang bekerja sebesar 4 pikonewton. Sebaliknya transisi dari ISO II ke ISO I berkurang dari 3.2 per detik saat gaya 0 pikonewton ke 1.7 per detik saat gaya yang bekerja sebesar 4 pikonewton.

Mereka juga mempelajari ketergantungan  TATA-binding protein (TBP) terhadap gaya-gaya yang bekerja padanya, sebuah ikatan yang ditemukan pada domain kehidupan eukariotik dan archae. Saat ini pengukuran gaya pada sistem ini masih sangat susah dilakukan karena perubahan yang terjadi pada TBP sangat susah dideteksi melalui metode AFM dan tweezers. Namun dengan menggunakan penjepit nanoskopis dan FRET, masalah ini dapat diatasi.

Penemuan ini membuka jalan baru untuk mengkuantifikasi sensitivitas dari faktor transkripsi yang dipengaruhi oleh distorsi hingga tegangan pada DNA serta pengorganisasian kromosom. Pengoperasian yang mudah dan dapat dilakukan secara paralel dalam jumlah yang banyak memberikan keuntungan dalam jumlah data yang dihasilkan. Gaya-gaya yang dapat dikerjakan juga mudah diubah-ubah mulai dari 0 pikonewton hingga 12 pikonewton dan dapat diperluas hingga 50 pikonewton. Metode ini juga memberikan tingkat fleksibilitas yang tinggi untuk pengamatan objek didalam larutan ataupun objek pada permukaan sehingga memberikan harapan untuk penyelidikan single-molecule yang sederhana dan dapat diadaptasi ke banyak sistem.(spektrumsains.com)

Sumber: P.C. Nickels et al., Molecular force spectroscopy with a DNA origami–based nanoscopic force clamp, Science (2016).